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Resumen en inglés

A new method using a magnetic nanoparticle-based colorimetric biosensing assay (NCBA) was compared with sputum smear microscopy (SSM) for the detection of pulmonary tuberculosis (PTB) in sputum samples. Studies were made to compare the NCBA against SSM using sputum samples collected from PTB patients prior to receiving treatment. Experiments were also conducted to determine the appropriate concentration of glycan-functionalized magnetic nanoparticles (GMNP) used in the NCBA and to evaluate the optimal digestion/decontamination solution to increase the extraction, concentration and detection of acid-fast bacilli (AFB). The optimized NCBA consisted of a 1:1 mixture of 0.4% NaOH and 4% N-acetyl-L-cysteine (NALC) to homogenize the sputum sample. Additionally, 10 mg/mL of GMNP was added to isolate and concentrate the AFB. All TB positive sputum samples were identified with an increased AFB count of 47% compared to SSM, demonstrating GMNP’s ability to extract and concentrate AFB. Results showed that NCBA increased AFB count compared to SSM, improving the grade from “1+” (in SSM) to “2+”. Extending the finding to paucibacillary cases, there is the likelihood of a “scant” grade to become “1+”. The assay uses a simple magnet and only costs $0.10/test. NCBA has great potential application in TB control programs.


2.
Tesis - Maestría
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Índice | Resumen en: Español |
Resumen en español

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infectocontagiosa provocada por el agente etiológico Mycobacterium tuberculosis (M. tb). Su principal método de diagnóstico es la baciloscopía, debido a su bajo costo, rápida entrega de resultados, y relativos reducidos requerimientos de infraestructura para su procesamiento. Sin embargo, su principal desventaja es su baja sensibilidad –siendo necesarias de 103-105 células de M. tb por mililitro de esputo para dar un resultado positivo-. Existen métodos más sensibles, pero costosos y poco accesibles en áreas socioeconómicamente desfavorables y con alta prevalencia de TB, como la Región Altos de Chiapas, zona de estudio de esta investigación. La implementación de Nanopartículas Magnéticas Eléctricamente Activas (NPs-MEAs), capaces de detectar estructuras específicas de la pared celular de diferentes microorganismos y de capturarlos, podrían mejorar la sensibilidad de la baciloscopía, sin aumentar significativamente sus costos. El principal objetivo de este trabajo fue evaluar la utilidad de las NPs-MEAs en la captura y detección de células de M. tb, a partir de muestras de esputo para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar (TBP), con el fin de mejorar el diagnóstico por baciloscopía.

Para ello se analizaron 88 muestras de esputo de personas con alta probabilidad a padecer TBP, comparando baciloscopías con y sin NPs-MEAs (BK-convencionales). Los hallazgos obtenidos son los siguientes: La formación de complejos NPs-MEAs-M. tb, se mejoró significativamente con la solución homogeneizante (descontaminante-digestor) NaOH 0.4%-NALC 2%, a una concentración óptima de 10 mg/ml de NPs-MEAs. Con este tratamiento las NPs-MEAs aumentaron un número de 7.82 células de M.tb/campo (DE=22.86) más respecto a las BK-convencionales. Concluyendo que las NPs-MEAs son útiles en la captura y detección de células de M. tb en muestras de esputo y que podrían mejorar las baciloscopías de rutina -BK-convencionales-.

Índice

Resumen
Glosario de acrónimos
1. Introducción
1.1 Tuberculosis (TB) y su agente etiológico
1.1.1 Distintivos biológicos de Mycobacterium tuberculosis (M. tb)
1.1.2 Naturaleza de la envoltura celular de M. tb
1.1.3 Características relevantes del genoma de M. tb
1.2 Transmisión, patología y manifestaciones clínicas de la TB
1.2.1 Patología de la TB
1.2.2 Tuberculosis latente (TBL)
1.2.3 Tuberculosis activa
1.2.4 Tuberculosis pulmonar (TBP)
1.2.5 Tuberculosis extrapulmonar
1.2.6 Factores que influyen en la severidad de la enfermedad
1.3 Aspectos epidemiológicos de la TB
1.4 Métodos de diagnóstico de la TB
1.4.1 Diagnóstico de la tuberculosis activa
1.4.1.1 Baciloscopía
1.4.1.1.1 Transporte de las muestras
1.4.1.1.2 Tinción y examinación microscópica
1.4.1.1.3 Ventajas y desventajas de esta técnica
1.4.1.2 Radiografía de tórax
1.4.1.3 Cultivos bacteriológicos
1.4.1.3.1 Descontaminación y digestión de muestras
1.4.1.4 Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos
1.4.2 Diagnóstico de TBL
1.4.2.1 Tuberculina
1.4.2.2 Interferon gamma release assay -IGRA-
1.4.3 Uso de Nanotecnología para el diagnóstico de TB
1.4.3.1 Clasificación de las Nanopartículas
1.4.3.2 Nanopartículas Magnéticas Eléctricamente Activas (NPs-MEAs) cubiertas con polianilina
1.4.3.3 Aplicaciones de las NPs-MEAs
1.4.3.4 NPs-MEAs y el diagnóstico de TB
1.5 Tratamiento anti-tuberculosis (anti-TB)
2. Justificación
3. Problema de Investigación
4. Objetivos
5. Hipótesis
6. Metodología
6.1 Diseño del estudio
6.2 Área de estudio
6.3 Unidad de análisis y recepción de muestras
6.4 Procedimientos de laboratorio
6.4.1 Síntesis de NPs-MEAs
6.4.2 Homogeneización: digestión y descontaminación de las muestras de esputo
6.4.2.1 Concentración óptima de NaOH como agente descontaminante de muestras de esputo con NPs-MEAs

6.4.2.2 Descontaminación y digestión de las muestras con NaOH 0.04% - NALC (0.025, 0.05, 1.0, 2.0 y 4.0%)
6.4.3 Determinación de concentración de agente surfactante-dispersor para mejorar la visualización microscópica de BAAR
6.4.4 Realización de baciloscopías y evaluación microscópica de BAAR
6.4.4.1 Baciloscopía de referencia para positividad de muestras
6.4.4.2 Baciloscopía para determinar la capacidad de las NPs-MEAs en detectar, aislar y concentrar BAAR de las muestras
6.4.5 Análisis de la información obtenida
6.4.5.1 Determinación de la solución que favoreció la homogenización –digestión y descontaminación– de las muestras de esputo para facilitar la unión de NPs-MEAs con las células de M. tb
6.4.5.2 Determinación de la concentración óptima de NPs-MEAs para extraer, concentrar y observar por medio de baciloscopía, células de M. tb.
6.4.5.3 Evaluación de la mejora en el número de bacilos detectados en baciloscopías con NPs-MEAs respecto a las baciloscopías convencionales
7. Resultados
7.1 Concentración óptima de agente descontaminante
7.2 Descontaminación y digestión de las muestras con NaOH 0.04% - NALC (0.025, 0.05, 1, 2 y 4%)
7.2.1 Tratamiento 1: NaOH 0.4% - NALC 0.025%
7.2.2 Tratamiento 2: NaOH 0.4% - NALC 0.05%
7.2.3 Tratamiento 3: NaOH 0.4% - NALC 1%
7.2.4 Tratamiento 4: NaOH 0.4% - NALC 2%
7.2.5 Tratamiento 5: NaOH 0.4% - NALC 4%
7.3 Determinación de concentración de agente surfactante-dispersor (Tween 80) para mejorar la visualización microscópica de BAAR
7.4 Determinación de la solución que favoreció la homogenización -digestión y descontaminación- de las muestras de esputo para facilitar la unión de NPs-MEAs con las células de M. tb
7.5 Determinación de la concentración óptima de NPs-MEAs para extraer, concentrar y observar por medio de baciloscopía, células de M. tb

7.6 Evaluación de la mejora en el número de bacilos detectados en baciloscopías con NPs-MEAs respecto a las baciloscopías convencionales
8. Discusión
8.1 Homogeneización -digestión y descontaminación- de las muestras de esputo con NaOH-NALC para facilitar la unión de NPs-MEAs con las células de M. tb
8.2 Concentración óptima de NPs-MEAs para extraer, concentrar y observar por medio de baciloscopía, células de M. tb
8.3 Mejora en el número de bacilos detectados en baciloscopías con NPs-MEAs respecto a las baciloscopías convencionales
9. Limitaciones del Estudio
10. Conclusiones
11. Recomendaciones
12. Notas Citadas en el Texto
13. Literatura Citada
14. Anexos


3.
Artículo
Resumen en español

Las enfermedades infecciosas (EIs) emergentes, re-emergentes y las tropicales desatendidas pueden ser localizadas en áreas geográficas específicas, pero fenómenos como el cambio climático, la globalización, las condiciones socioeconómicas y la migración, entre otros, pueden facilitar su rápida transmisión hacia otras regiones. Brotes recientes de Zika, Chikungunya, y Ébola han puesto en alerta la salud pública mundial. Otras enfermedades infecciosas aún persisten y representan severos problemas de salud pública, tales como la tuberculosis, el VIH-sida, la leishmaniasis, el dengue, la malaria y la enfermedad de Chagas, entre otras. Para el diagnóstico, prevención y disminución en la propagación de las EIs, es necesario implementar métodos de diagnóstico precisos, rápidos y accesibles que permitan su atención médica de manera oportuna. Describimos el uso de la nanotecnología, específicamente de “Alocilja Nanopartículas Magnéticas (AMNs)” acopladas a un biosensor, como un nuevo método de diagnóstico de las EIs. Ilustramos su uso potencial para el diagnóstico de la tuberculosis.

Resumen en inglés

Emerging, re-emerging and neglected tropical infectious diseases (IDs) can be restricted to specific geographic zones, but climate change, globalization, social conditions, and migration, among other factors, can trigger their dissemination worldwide. Outbreaks of Zika, Chikungunya and Ebola have threatened public health worldwide. The rapid transmission of these viral diseases exemplifies the potential quick spread of an infectious disease. Yet several infectious diseases that are of major concern for public health, namely tuberculosis, VIH-sida, Leishmaniasis, dengue, malaria, Chagas, among others. To detect and combat the spread of these IDs, we urge, rapid, and accessible diagnostic tests are needed to identify specific pathogens in order to provide early medical care. In this paper, we review the use of nanotechnology, specifically the Alocilja functionalized magnetic nanoparticles (AMNs) coupled to a biosensor, as a new and quick diagnostic test to detect IDs, and exemplify their potential use in the diagnosis of tuberculosis.